タンパク質実験関連でよく使う試薬の調製方法

Buffer C(ストック)

1M Hepes-K(pH7.8) 0.5ml
3M KCl 7ml
0.5M EDTA 10ul
1M MgCl2 250ul
グリセロール 10ml
ミリQ水 up to 50ml

1.  グリセロールをメスシリンダーで計量する。

2.  ミリQ水を少量加え、グリセロールの粘度を下げ、スターラーを回しながら他の試薬を加えていく。

3.  ミリQ水で50 mLに合わせ、室温保存。

使用する際には終濃度0.1%のNP40(界面活性剤)やプロテアーゼ阻害剤をストック液に添加する。
10% NP40を作っておき、全容量1 mLのバッファーCを作るのであれば、10 uLの10% NP40を加える。
プロテアーゼ阻害剤はRocheの「complete」が扱いやすい。

30% Acryl-bis

Acrylamide 30g
N-N’-methylene-bisacrylamide 0.8g
ミリQ水 up to 100ml

アクリルアミドのモノマーは神経毒である。吸引したり、直接手に触れることがないように操作する。
アクリルアミドは熱や光に不安定であることから、遮光して冷蔵庫に保存する。

1.  50 mL程度のミリQ水をビーカーに入れ、アクリルアミド30 g、ビスアクリルアミド0.8 gを加えて、スターラーなどで完全に溶かす。

2.  100 mLになるようにメスアップ。

溶液は遮光の上、冷蔵庫保存。オートクレーブはしない。

1.5M Tris-HCl(pH8.8)-0.4%SDS

Tris 91g
ミリQ水 400ml
SDS 2g
メスアップ 500ml

1.  400 mL程度のミリQ水をビーカーに入れ、Tris91 gを加えて、スターラーなどで完全に溶かす。

2.  6N HClでpH8.8に調製後、SDSを2 g加えて完全に溶かす。

3.  500 mLにメスアップ。

溶液は冷蔵庫保存。オートクレーブはしない。

0.5M Tris-HCl(pH6.8)-0.4%SDS

Tris 6.05g
ミリQ水 70ml
SDS 0.4g
メスアップ 100ml

1.  70 mL程度のミリQ水をビーカーに入れ、Tris6.05 gを加えて、スターラーなどで完全に溶かす。

2.  6N HClでpH6.8に調製後、SDSを0.4 g加えて完全に溶かす。

3.  100 mLにメスアップ。

溶液は冷蔵庫保存。オートクレーブはしない。

10% APS

Ammonium Persulfate(過硫酸アンモニウム) 1g
ミリQ水 10ml

過硫酸塩類は、強力な重合開始作用を持つ。
APSは白色粉末または粒状。水に溶けやすい安定な結晶である。

1.  15 mLのチューブ等を利用し、10 mLのミリQ水に過硫酸アンモニウム1 gを加えて完全に溶かす。

2.  エッペンチューブに適当な量ずつ分注し、遮光の上、-20°Cで保存。

溶液は遮光の上、-20°Cで保存。

水飽和ブタノール

n-ブタノール 20ml
蒸留水 20ml

1.  n-ブタノール20 mLと蒸留水20 mLを50 mLのチューブに入れて蓋をしっかり締めシェイクする。

2.  軽く遠心する。

3.  室温で保存する。

溶液は室温保存。PAGEのゲル作りのときには上層のブタノール層を使う。

10xRunningバッファー

Tris 30.3g
Glycine 144g
SDS 10g
蒸留水 1000ml

1.  600 mL程度の蒸留水をビーカーに入れ、Tris30.3 g、Glycine144 g、SDS10 gを加えて、スターラーなどで完全に溶かす。

2.  蒸留水で1 Lにメスアップ。

3.  室温で保存。

トランスファーバッファー(MeOH20%)

Tris 15.2g
Glycine 72g
メタノール 200ml
蒸留水 1000ml

トランスバッファー中のメタノールは、タンパク質をゲル中に固定させる作用があるため、濃度が高いとゲルからタンパク質が抜けにくくなる。

1.  500 mLの蒸留水にTris15.2 g、Glycine72 gを完全に溶かす。

2.  200 mLのメタノールを加え、蒸留水で1000 mLにメスアップし、室温保存。

トランスファーバッファー(MeOH5%)

Tris 15.2g
Glycine 72g
メタノール 50ml
蒸留水 1000ml

トランスバッファー中のメタノールは、タンパク質をゲル中に固定させる作用があるため、濃度が高いとゲルからタンパク質が抜けにくくなる。

1.  500 mLの蒸留水にTris15.2 g、Glycine72 gを完全に溶かす。

2.  50 mLのメタノールを加え、蒸留水で1000 mLにメスアップし、室温保存。

10xTBS (Tris buffered saline)

Tris 24.2g
NaCl 80g
メスアップ 1000ml

1.  600 mL程度の蒸留水をビーカーに入れ、24.2 gのTris、80 gのNaClを加えて、スターラーなどで完全に溶かす。

2.  6N HClでpH7.6に調製後、蒸留水で1000 mLにメスアップする。

1xTBST

10xTBS 100ml
Tween 20 0.5ml
滅菌蒸留水 900ml

  1xTBSを作り、0.5 mLのTween 20を加えて、スターラーなどで混合する。

ブロッキング溶液(0.3% スキムミルク / TBST)

スキムミルク 0.15g
1xTBST 50ml

  50 mLのチューブにて50 mLの1xTBSTに0.15 gのスキムミルクを溶かす。

100mM PMSF

PMSF 1.74g
イソプロパノール 100ml

  PMSF (Phenylmethane sulfonyl fluoride, MW = 174.2)は、セリンプロテアーゼ阻害剤である。
  1.74 gのPMSFを100 mLのイソプロパノールに溶かし、0.22 umのフィルターに通す。遮光して-20°Cで保存。通常、最終濃度で1 mM程度加える。

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