PromegaのDual-luciferase Assayのシステムを用いた例

1.  70〜80%コンフルエントの接着細胞のプレートの培地を捨て、PBSで2回洗う。
2.  2mlの1xトリプシンを入れて全体にいきわたらせ、細胞をはがす。
3.  5ml程度の培地の入った50mlチューブに細胞を移す。
4.  1,000rpmで3分間程度遠心する。
5.  1mlの培地を加えピペッティングして細胞をほぐし、必要に応じて数倍に希釈して細胞数を数える。
6.  細胞数に応じて適当量の培地に細胞を懸濁し、48-wellプレートに250ulずつ細胞をまく。大雑把には、30〜35ml程度の培地に懸濁することになる。
7.  1時間程度37°Cでインキュベーションする。
8.  待つ間にpRL-TK (Renilla expression vector)と目的のプロモーターで組み換えたpGL3を調製する（コントロールとして、組み換えてない空のpGL3も用意）。それぞれ、0.005ul/ul、0.1ug/ulに調製後well数分まとめて調製する。例えば、8wellだったら調製は10well分で行い、10ulずつを調製する。
9.  19.4ulの血清freeの培地（抗生物質入り）を分注する。
10.  0.6ulのFuGENE6を前工程の血清free培地に加える。加えるときは、チューブの壁面を伝わらせずに、直接培地に加えること。ボルテックスをしてはいけない。
11.  15分間、4°Cでインキュベーションする。
12.  pRL-TKと組み換えたpGL3を混ぜ（コントロールでは組み換えていない空のpGL3）を混ぜ、2ulずつ加える。
13.  15分間室温でインキュベーションする。
14.  48-wellプレートに加える（22ulが入ることになる）。
15.  30秒間プレートの底面をクリーンベンチのテーブルにこすりながら揺する。
16.  37°Cで3時間インキュベーションする。
17.  エフェクタープラスミドを加えたい場合、1wellあたり100ngずつ投入する。ここでの投入量は、予備実験にて決定しておかなければならない。
18.  30秒間プレートの底面をクリーンベンチのテーブルにこすりながら揺する。
19.  24〜48時間程度培養する。

PromegaのDual-luciferase Assayのシステムを用いた例

1.  24〜48時間程度培養したら、培地を捨て、PBSで細胞を洗う。
2.  5xPassive Lysis BufferをミリQ水で1xに稀釈し、各wellに50ulずつ加える。
3.  ここで保存したいときには、プレートにテープで封をして-30°C以下で保存してもよい。そのままアッセイしたい場合にも一度冷凍する。
4.  室温に戻して融かす。
5.  Luminometer (TD-20/20)を用意する。
6.  左上にある主電源を入れる。
7.  Protocolを押す。
8.  Promega Protocol（左上）を押す。
9.  DLR-O-INJ（右2段目）を押す。integrationは、10secになっている。
10.  OKを押す。
11.  まず、0点補正のために基質のみの発光量を測定する。50ulのLARIIをチューブに入れ、mesureを押す。
12.  50ulのstop & Gloを加えピペッティングしOKを押す。
13.  10ulのサンプルをチューブに取り、50ulのLARIIを加えピペッティングし、mesureを押す。
14.  50ulのstop & Gloを加えピペッティングしOKを押す。
15.13、14の工程を繰り返す。